• 利用目的 創薬ターゲット蛋白質の構造は、新薬の探索や最適化に重要な情報であるが、膜蛋白質などの高難易度ターゲットの構造決定は、現時点では非常に難しく時間を要する。本課題では、SACLAにおいて測定装置開発を進めるグループと、主要な創薬ターゲット蛋白質の構造を研究する国内の複数のグループを緊密に連携させることにより、各種の創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法を目指すものである。具体的には、多数の微小結晶をインジェクターで噴出し、それにXFELパルスを照射し、化学結合の切断より短い時間(<10fs)でデータを測定する装置を技術開発の核とする。数多くの結晶から集めた回折データよりコンプリートしたデータセットを作成し、構造解析を行うことを目指している。 本課題は、X線自由電子レーザー重点戦略研究課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」の一環として実施する。H24年度の1回目はSPring8と同様なゴニオメーター、2回目は短カメラ長タイプマルチポートCCD検出器(MPCCD)と汎用イメージングチャンバー(MAXIC)を用いて測定実験を行った。H25年度の前半は専用イメージングチャンバーをマウントするとともに、液体ジェットインジェクターに加え、循環式液体インジェクターを開発した。後者は、サンプルをペリスタポンプでサンプル溶液をリサイクルする方式で、一部の蛋白質を除いてデータの質の低下を見られず、サンプル量の低減に有効であった。リゾチーム等のモデル蛋白質を用いて、両インジェクターにおいて、サンプル調製方法を含めて最適な実験•測定条件を求めた。 今回の実験では、モデル蛋白質で求めた測定条件をもとに、液体ジェット式や循環式のインジェクターを用いて、様々な蛋白質についての測定やデータ解析を実施する。また、創薬ターゲットとして重要な膜蛋白質の構造解析を可能とするために、脂質キュービック相(LCP)を用いた結晶化に対応するインジェクターの開発を検討する。さらに、構造解析の一連の流れを種々の結晶で検討することによって、現行の装置システムにおいて最適な実験条件を明らかにするとともに、装置システムや解析システム等の課題を抽出する。
• 試料名、実験方法、使用装置•実験測定条件 1μmコヒーレント集光装置、専用チャンバー、インジェクター、短カメラ長タイプマルチポートCCD検出器などから構成される装置システムを用いて測定実験を行う。インジェクター部分は、液体ジェット式、循環式やLCP対応方式の3種であり、何れもサンプル温度維持ユニットを備えている。LCP対応方式は、短期間で装置を作成して測定実験を行うために、市販のシリンジを油圧ポンプで押すというシンプルな構造で暫定的なインジェクターを採用した。また、液体ジェット式においてノズル部分が詰まった場合に速やかに交換するために、液体ジェット式のノズル部分を3つ、および循環式のノズルを1つをヘッド部分に備えたチャンバーを新規に作成した。このヘッド部分は簡単にLCP対応方式のヘッドに交換することができる。 液体ジェット式では、タンパク量40-50 mg程度を必要とするが、測定後にその溶液を回収して再度測定を行うならば、これより少ない量でも測定が可能である。回収やサンプルの再度セットするなどの作業が伴う。循環式では、容量5 mlを必要とするが、数mg/mlのタンパク量でも測定時間を長めに設定すればデータ取得が可能である。LCP対応方式では、30ul程度のLCP又は高粘度溶液を準備した場合、タンパク量0.5mg程度でデータ取得が可能である。 膜蛋白質は検出器の量子効率が良い7KeVで測定を行ったが、この波長において現行ではカメラ長の関係で2Å程度分解能が最大である。そのため、2Å以上の分解能が予想される、主に水溶性蛋白質は10KeVでの測定を行う。また、新規構造の決定の技術開発のために、12.6KeVで異常分散検出を検討する。
• 測定内容、結果の概要 表1に示した通り、2013年12月の5シフト、2014年2月の3シフトのビームタイムにおいて、それぞれ22、22のサンプルの測定を実施した。12月の測定では、液体ジェット式と循環式の測定数を比較すると、タンパク量が低減し作業効率が良いために、循環式での測定数が多くなった。2月の測定では、循環式とLCP対応方式の測定数を比較すると、タンパク量が循環式に比べて1/50~1/100に低減したLCP対応方式での測定が増加した。 LCPを用いた結晶化は主に膜蛋白質の結晶化に用いられ、今回のような測定方法では、そのままの状態で噴出し測定を行う。そのため、結晶のサイズだけでなく、結晶の密度や分散等を検討し、測定サンプルを準備することがポイントであることが明らかになった。一方、12月の実験で、水溶性タンパク質を集め、高粘度溶液等に分散する方法を確立し、LCP対応方式での測定が可能となった。2月の実験では、実験条件として循環式で実施する必要があるサンプルを除いて、水溶性蛋白質においても主にLCP対応方式での測定となった。 表2に示した通り、2013B期全体で、膜蛋白質と水溶性蛋白質について、それぞれ9種類、15種類の蛋白質の測定を実施した。その結果、膜蛋白質では1種類の構造決定に成功し、現在、論文を作成中である。水溶性蛋白質に関しては、モデル蛋白質を含めて7種類の構造決定に成功している。2013B期から装置開発を進めたLCP対応方式において、膜蛋白質の構造決定に成功したことは特筆すべきことである。さらに、複数の膜蛋白質で、構造決定に至らないものの3Åの反射が得られている。 2013年の前期と後期を通して、液体ジェット方式や循環式の装置システムがほぼ完成した。LCP対応方式に関しても、原型が出来上がり、その装置システムによって、膜蛋白質等の測定が可能であることを実証した。一方、種々の蛋白質についてデータ解析を行うことによって、データの質、データ処理の方法やデータ解析の方法などに、通常の放射光では見られない課題があることがわかってきた。これらの課題を検討•克服しながら、データ取得ができた蛋白質から論文作成を進めていく予定である。 |