利用目的：
創薬ターゲットの構造は新薬の探索、最適化に重要な情報であるが、膜蛋白質などの高難易度ターゲットの構造決定は現時点では非常に難しくかつ時間を要する。重点課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」は、SACLAにおいて測定装置開発を進めるグループと主要な創薬ターゲット蛋白質の構造研究を行っている国内の複数のグループを緊密に連携させることにより、各創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の確立を目指すものである。具体的には、多数のナノ結晶をインジェクターで噴出し、それにXFELパルスを常温等で当て、化学結合の切断されるより短い時間（＜10fs）でデータを測定する技術開発を核とする。数多くの結晶より集めた回折データよりコンプリートしたデータセットを作成し、構造解析を行うことを目指している。新規な装置システムの開発では、装置の開発を行ってモデルタンパク質で実証実験を行うことを繰返し、次いで膜蛋白質などの高難易度ターゲットの測定が可能となる。また、モデル蛋白質で得られたデータの処理や解析方法の開発を進めるが、特に新規な構造決定には、分子置換法を用いることができないため、その他の手法を確立する必要もある。
XFELパルスは、化学結合の切断されるより短い時間（＜10fs）で結晶に照射されるために、SPring8などの放射光で起こる放射線損傷を回避してデータを取得できると考えられている。例えば、GLUT5/Fv複合体結晶は、これまでにSPring8 BL41XUやBL32XUで測定を行ったが、結晶化条件を最適化しても放射線損傷を受け易く、最高分解能は3.3Å程度であった。一方で、SACLA BL3でSPring8と同条件で測定すると、1.9Åまで分解能が向上し、これは放射線損傷が抑制されたためと考えている。
本課題は、重点課題の全体計画の一環として推進され、SACLAのXFELパルスが、通常の放射光と比較して、放射線損傷を抑制することを実証する。さらに、単結晶を用いた高分解能解析という新しいXFELの使い方を示した最初の例になる。また、現在開発中の装置システムを膜蛋白質などの高難易度ターゲットに適応する際には、比較実験や基礎実験となり、全体計画の推進に非常に重要である。
今回は、2012B期と同様な装置（SPring8同様のゴニオメーター）にSPring8で用いるのと同様の大きさの結晶をマウントして、結晶をループにマウントし定温窒素ガス吹き付け下でデータの測定を行う申請を行ったが、課題2013A8039で使用するリキッドジェット方式の装置システムの提供された。そのため、この装置システムを利用するために、結晶化条件に関して種々の検討を行い、好熱性紅藻由来ABC輸送体のみに関して、試料を準備することが可能となった。
試料名、実験方法、使用装置•実験測定条件：
測定は１回で、1μmコヒーレント集光装置、ナノクリスタルチャンバー、リキッドジェットインジェクター、サンプル温度維持ユニット、短カメラ長タイプマルチポートCCD検出器などで構成される装置システムで行った。ABC輸送体は微結晶として、5~7μmサイズと10~20umサイズの２種、各々4mg/mlの濃度で約5mlを測定した。また、モデルタンパク質としてルシフェラーゼを5~20μmサイズを3.5mlで３回測定した。リキッドジェットインジェクターのノズルサイズは何れも75μm、0.15ml/minの流速で、10.1 keVの条件で実施した。
測定内容、結果の概要
ABC輸送体では5-7µmの結晶では635枚、10-20µmの結晶では2365枚の回折点を含む画像を取得した。最大分解能は約６Åだった。しかし、回折点が少なく、インデックスはできなかった。ルシフェラーゼでは、Indexingに成功した回折像263枚、1.7A分解能まで処理した結果、completeness約47% Redundancy 約2.9であった。 |