目的
創薬ターゲットの構造は新薬の探索、最適化に重要な情報であるが、膜蛋白質などの高難易度ターゲットの構造決定は現時点では非常に難しくかつ時間を要する。本提案ではSACLA において測定装置開発を進めるグループと主要な創薬ターゲット蛋白質の構造研究を行っている国内の複数のグループを緊密に連携させることにより、各種創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の確立を目指すものである。具体的には、多数のナノ結晶をインジェクターで噴出しそれにXFEL パルスを当て、化学結合の切断されるより短い時間（<10fs）でデータを測定する装置を技術開発の核とする。数多くの結晶より集めた回折データよりコンプリートしたデータセットを作成し、構造解析を行うことを目指している。今回の実験では今回の実験では、まず容易かつ大量に結晶を用意できる、リゾチーム結晶をモデル結晶として、結晶の大きさ、サンプル溶液の粘性、界面活性剤の有無、脂質の有無等の条件を変えることによってサンプルインジェクターのテストを行う。リゾチームに関してはキュービック相中を含め結晶を得る条件が細かく検討されている。リゾチームを用いてサンプルインジョクションの条件を検討及びサンプルチェンバーのアラインメント等を検討した後は、実際の創薬ターゲット膜タンパク質を用いて測定実験を行う。
本プロジェクトは五年間の自由電子レーザーの一環であり、初年度は汎用イメージングチャンバー (MAXIC)を用いて、次年度の専用チャンバーの開発に向けた技術開発を行う。今回のビームタイムではまずモデル蛋白質（リゾチーム）を用いて、各種条件を変えて、インジェクションに適したサンプル状態を検討する。また実際の創薬ターゲット蛋白質微結晶を用いて回折実験をおこなう。また実際に現在の検出器で回折像を記録し、データの処理を行う。実際に結晶が安定にインジェンクションされているか、きちんとビームにあたっているかなどは実際のビームを用いた実験で始めて評価が可能でありSACLAでの実験が不可欠である。得られた結果より、現在のインジェクター、検出器、測定チェンバーの改良を行い、次年度の専用チェンバーの開発につなげる。またインジェクターに適したサンプルの調製法を確立する。
試料名、実験方法、使用装置・実験測定条件
測定は二回あり、１度目（１２年１０月）はハードウエアの製作が間に合わなかったので、SPring-8同様のゴニオメーターにSpring-8で用いるのと同様の大きさの結晶をマウントして、結晶をループにマウントし低温窒素ガス吹き付け下でデータの測定を行った。共同研究５チームが１０種類のサンプルの測定を行った。二度目（１２年３月）はmpCCDのマウントの変更が終了したため、MAXICチャンバーを用いて、液体ジェットでサンプルを打ち出し実験を行った。ジェットの調整が難しいので、資料として構造既知のモデルタンパク、リゾチーム及びインスリンを用いて実験を行った。
測定内容、結果の概要
１回位目の実験では、測定した結晶のうち一つを除いて、SPring-8(BL32XU)で１秒間露出したのより、同等か弱い反射しかしめさないものが多かったが、サンプルの一つグルコースの輸送体についてはSpring-8での分解能が3.2Åに対し、2.0Å以上のデータを観測した（図１）。これは結晶が非常に放射線損損傷に弱いため、SPring-8では測定の最中に結晶の損傷がおこっていた物が、SACLAの短いパルス特性により損傷がおこる前にデータがとれたためであると考えられる。二回目の実験では300,000枚以上のリゾチームのデータを測定することができた。データの分解のは1.8Å以上（検出気の限界）であった。その内一条件の１万４０００枚のイメージより、６１４８枚に回折像が移っていることが確認され、３５２０枚に指数をつけ積分することが可能であった。このデータより構造因子を計算し、分子置換法により良好な電子密度図を描き、モデルを精密化することに成功したこと（図２）。コンプリートネスは１００％であり、データのリダンダンシーは最低分解のシェル（6.3Å）で47.2(6.3Å)そして最高分解のシェル（1.8Å）で5.9であった。 |